Auf der Erdenkolonie Eden Prime wurde ein unbekanntes außerirdisches Artefakt der Protheaner gefunden. Die Spielfigur Commander Shepard - welche als Mann oder Frau gespielt werden kann - befindet sich in geheimer Mission an Bord eines Fregattenprototyps der Allianz, der SSV Normandy, um das Artefakt zu bergen. Bei ihrer Ankunft wird Eden Prime jedoch von den synthetischen Geth (eine cybernetische Rasse) im Auftrag des Turianer Saren angegriffen, welcher versucht, das Artefakt in seinen Besitz zu bringen. Shepard kann sie mit seiner Einheit zwar daran hindern, doch das Artefakt zerstört sich selbst, nachdem er ihm zu nahe kommt. Zuvor brennt es allerdings einige Visionen in seinen Kopf, so wie es dies bereits bei Saren getan hatte, in denen eine Warnung der Protheaner vor den Reapern gezeigt wird (Allerdings erfährt das der Spieler erst später im Verlauf des Spiels). Shepard erhält daraufhin den Auftrag, Sarens dunklen Plan herauszufinden, mit dem er die Galaxie ins Verderben stürzen will, und ihn daran zu hindern. Er wird daraufhin zu drei Orten geschickt: Dem Artemis Tau Cluster, Feros und Noveria. Nachdem er zwei dieser Orte besucht hat, wird er nach Virmire geschickt, wo er auf Saren trifft und erfährt, dass er nur ein Handlanger von Sovereign, einem Reaper ist. Shepard reist nun nach Ilos, um Saren aufzuhalten, kommt jedoch zu spät. Dort erfährt er durch ein 50.000 Jahre altes Protheanisches Hologramm, dass die Portale und die Citadel von den Reapern erbaut worden sind, die wussten, dass alle intelligenten Lebensformen diese benutzen würden. Die Citadel, die immer die Hauptstadt des biologischen Lebens war, ist eigentlich ein eigenes Portal, durch das die Reaper zuerst kommen und die Regierung auslöschen, sodass alle biologischen Lebensformen ohne Führung sind, und es die Reaper einfacher haben, ihren Genozid durchzuführen. Dieser Vorgang wiederholt sich nach den Angaben des Hologramms immer, wenn sich die Lebewesen der Galaxie technologisch weit genug entwickelt haben. Shepard folgt Saren auf Illos durch die Röhre (einer kleinen Version eines Massenportals, dass von den letzten Protheanern erbaut wurde) zur Citadel, wo inzwischen eine Schlacht zwischen den Geth und der Citadelflotte tobt. Dort stellt er Saren und der Spieler kann entscheiden, ob er den Rat rettet oder ihn sterben lässt. Nach dem Kampf gegen Saren zerstört die eingreifende Allianzflotte die Sovereign.